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在最近發(fā)表在Cell Reports上的一項研究中，研究人員證明了成簇的定期散布的短回文重復序列（CRISPR）介導的膠質母細胞瘤（GBM）細胞的消除。

原發(fā)性膠質母細胞瘤是一種侵襲性腫瘤，治療具有挑戰(zhàn)性，盡管采用多種治療方案，其中位生存期為12至15個月。研究已經(jīng)表明廣泛的腫瘤內(nèi)異質性，細胞亞群表現(xiàn)出不同的基因表達模式、突變、表觀遺傳狀態(tài)和拷貝數(shù)畸變，這也使得靶向特定分子過程的治療無效。

替莫唑胺（TMZ）是目前治療GBM的一線化療藥物，對TMZ的敏感性取決于O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）啟動子的甲基化。雖然基于TMZ的治療可以提高生存率，副作用較少，但大多數(shù)患者都會經(jīng)歷疾病進展。

TMZ還增加了體細胞突變率，并與DNA錯配修復（MMR）途徑的丟失和腫瘤基因組不穩(wěn)定性相結合，導致超突變。目前，對于高度突變的神經(jīng)膠質瘤沒有有效的治療方法。因此，迫切需要消除GBM細胞的療法，無論其突變譜如何。

在本研究中，研究人員引入了基因組/癌癥脫落，這是一種基于CRISPR的治療策略，通過靶向腫瘤基因組中的獨特重復序列來治療原發(fā)性/復發(fā)性GBM。首先，他們將患者的原發(fā)性和復發(fā)性GBM與其天然基因組進行了比較。患者接受手術切除，輔助放療和TMZ化療，并在11個月后復發(fā)。

腫瘤突變負荷的定量顯示，原發(fā)性和復發(fā)性GBM的突變中位數(shù)分別為123和217個/兆堿基，均歸類為高突變。在原發(fā)性和復發(fā)性GBM中，分別有超過4400和11600個蛋白質編碼突變和451484和698557個非編碼基因組突變。

研究人員計算了患者天然基因組以及原發(fā)性和復發(fā)性GBM中可能的化膿性鏈球菌CRISPR相關9（Cas9）單向導RNA（sgRNA）。在該靶空間中可能存在數(shù)億個sgRNA，稱為“sgRNA-ome”，其中大部分具有多個靶基因座。研究小組將這些具有重復靶位點的sgRNA稱為sgCIDE（用于通過編輯CRISPR誘導的死亡）。

接下來，他們選擇了前10個sgCIDE，具有3000至300000個靶位點，以評估CRISPR-Cas9通過靶向重復序列消除GBM的能力。Cas9和10種sgCIDE在LN-229和U-251 GBM細胞中的穩(wěn)定表達引起穩(wěn)健和快速的細胞消耗，而表達非靶向sgRNA的那些細胞不消耗。

表達Cas9的細胞在用sgCIDE轉導后24小時顯示出廣泛的基因組片段化。此外，實時定量活細胞成像表明，sgCIDE在轉導后第1天引起生長抑制，并在第2天引起細胞死亡。接下來，研究小組在TMZ敏感和耐藥GBM中測試了基因組破碎。

將表達Cas9的TMZ抗性LN-18和T98 G以及TMZ敏感性LN-229和U-251 GBM細胞用TMZ處理或用含有sgCIDE的慢病毒載體轉導。細胞活力定量顯示TMZ劑量滴定的預期效應，僅在TMZ敏感細胞中有明顯的致死性。相比之下，sgCIDEs的表達在所有四種細胞系中引起病毒滴度依賴性致死性，與MGMT啟動子的甲基化狀態(tài)無關。

集落形成測定顯示，相對于二甲亞砜（DMSO）處理的細胞，TMZ處理的U-251細胞中的集落減少一到兩個對數(shù)尺度，而用sgCIDE轉導觀察到集落減少兩到三個對數(shù)尺度。然而，一些sgCIDE轉導的細胞存活并形成集落。

建立了這些逃逸克隆的單克隆細胞系，并開發(fā)了表達sgRNA和mCherry或編碼sgRNA和mCherry標記的Cas9的一體化版本的慢病毒載體。用僅提供新sgRNA的載體再處理逃逸克隆未能引起細胞耗竭，而用一體化載體再處理導致有效的細胞消融。

其他研究表明，有效消除細胞所需的最小DSB數(shù)量對于完全互補的靶位點為30個，對于具有單個錯配的靶位點為70個。由于基因組粉碎的靶點也存在于正常基因組中，研究人員推測，高度突變的膠質瘤中的癌癥特異性突變可能具有獨特的序列，可以用于癌癥特異性基因組粉碎（癌癥粉碎）。

復發(fā)性GBM顯示出高度突變GBM的特征性TMZ突變特征（升高的胞嘧啶至胸腺嘧啶轉化）。接下來，研究小組使用復發(fā)性GBM衍生的細胞系來評估TMZ突變特征是否可以用于特異性靶向和細胞消融。這種患者來源的細胞系（PDCL），命名為SF 11411，具有與其他GBM細胞系相似的基因組破碎敏感性。

研究人員確定了10種重復的sgRNA，這些sgRNA對復發(fā)性腫瘤是獨特的。為了驗證，該團隊在正常人類星形膠質細胞（NHA）和PDCL SF 11411中進行了大規(guī)模CRISPR篩選。CRISPR文庫包括（約5000個）在單個基因座或多個基因座處靶向非編碼和編碼基因組的指導、sgCIDE、非靶向對照和安全港參考。

使用下一代測序來比較NHA，并且在轉導后第1天和第28天用CRISPR文庫以單拷貝轉導PDCL細胞。如預期的，大多數(shù)sgCIDE在兩種細胞系中耗盡。非靶向對照在兩種細胞系中具有中性效應，而癌癥特異性重復sgRNA僅在SF11411中耗盡，但在NHA中富集。

該研究描述了CRISPR介導的基因組/癌癥粉碎治療復發(fā)性膠質瘤。癌癥粉碎依賴于靶向重復的腫瘤特異性基因座，觸發(fā)CRISPR介導的基因組片段化和DNA損傷誘導的細胞死亡。此外，基因組破碎與TMZ敏感性和GBM細胞的表觀遺傳狀態(tài)無關。

大多數(shù)細胞屈服于最初的DNA損傷，罕見的逃逸者可以有效地重新治療。腫瘤特異性重復序列的存在使得能夠通過靶向治療誘導的突變特征來切割癌癥?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)癌癥特異性療法以治療高度突變的膠質瘤和其他高度突變的癌癥提供了潛在的途徑。

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