中文標題：HOXD9-介導的PAXIP1-AS1通過PABPC1/PAK1調控胃癌的進展

發(fā)表期刊：Cell Death Dis

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：9.685

發(fā)表時間：2023年5月

合作單位：南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院

運用技術：RNA pull down MS、RNA免疫沉淀（RIP）、染色質免疫沉淀（CHIP）、LC-MS/MS質譜檢測（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景：

胃癌（GC）患者的預后五年生存率不到25%，高死亡率歸因于診斷不及時、臨床表現(xiàn)延遲和侵襲轉移率高，因此需要更好地了解GC進展和轉移的分子機制，據(jù)報道，PAXIP1-AS1與癌癥的發(fā)生有關，然而對其在GC中的作用仍知之甚少。本研究探索了HOXD9/PAXIP1-AS1/PAPPC1/PAK1信號軸在GC轉移中的重要性，為GC診斷標志物和治療靶點的開發(fā)提供了新思路。

● 研究結果

1、PAXIP1-AS1受到HOXD9的轉錄抑制

先前的研究已經發(fā)現(xiàn)轉錄因子HOXD9促進胃腸癌EMT誘導的轉移，因此本項目首先采用WB實驗驗證了HOXD9蛋白在GC細胞系中的表達，其在AGS、NCI-N87、SNU-719、MKN-45、HGC-27、BGC-823、MGC803和SGC-7901細胞系中的表達水平顯著高于GES-1細胞系（胃黏膜上皮細胞），而在MKN-74、SNU-1和SNU-5中表達較低（圖1A）。HOXD9過表達細胞的RNA測序和HGNC數(shù)據(jù)庫分析確定并注釋了14個差異表達的lncRNA（圖1B），TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)低表達PAXIP1-AS1的GC患者的總生存期較短，因此選擇PAXIP1-AS1做進一步研究。HOXD9的過表達（圖1C1）或敲低（圖1C2）證實了HOXD9與PAXIP1-AS1的表達呈負相關。

接著，軟件預測發(fā)現(xiàn)HOXD9在PAXIP1-AS1啟動子區(qū)有兩個結合位點（圖1D，E），接著分別使用HOXD9抗體和正常兔IgG對GC細胞進行染色質免疫共沉淀技術（ChIP）分析，PCR結果表明HOXD9蛋白只與第二預測位點（?1503 to ?1513）結合（圖1F）。雙熒光素酶報告基因實驗表明，第二結合位點對于HOXD9抑制PAXIP1-AS1至關重要（圖1G）。這些實驗結果表明HOXD9與特定的PAXIP1-AS1啟動子結合以抑制其轉錄。

圖1

2、PAXIP1-AS1抑制GC進展

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常組（n=211）相比，GC組（n=408）組織中PAXIP1AS1的表達較低（圖1A），qPCR實驗技術檢測了PAXIP1-AS1在75對匹配的正常和癌性胃組織中的表達，結果表明PAXIP1-AS在GC中顯著下調（圖2B，C）。此外，PAXIP1-AS1在除BGC-823外的大多數(shù)GC細胞系中的表達下調（圖2D），且與HOXD9的表達呈負相關（圖1A）。為了確定PAXIP1-AS1在GC細胞中的亞細胞定位，對GES-1和MKN-74細胞進行細胞質/核分離，發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1在細胞質中的表達高于細胞核（圖2E），原位雜交（ISH）對10對正常和GC組織的研究得到了一致的結果（2F）。GC組織樣本中PAXIP1-AS的檢測結果表明，PAXIP1-AS1的表達與腫瘤侵襲顯著相關（圖2G、H），這些發(fā)現(xiàn)表明PAXIP1-AS1在GC進展中作為腫瘤抑制因子起作用。

圖2

3、PAXIP1-AS1在體外和體內抑制GC細胞的生長、遷移和侵襲

為了評估PAXIP1-AS對體外細胞功能的影響，首先在AGS和MKN-45細胞中轉染PAXIP1-AS1質粒過表達PAXIP1-AS1，在MKN-74細胞中轉染siRNA敲低PAXIP1-AS1。EdU熒光染色對細胞增殖率的測定結果表明，PAXIP1-AS1過表達組中的陽性細胞平均百分比顯著降低（圖3A），敲低組則相反（圖3B）。克隆形成實驗進一步證明，過表達或敲低PAXIP1-AS1分別導致GC細胞增殖減少或增加（圖3C,D）。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1敲除細胞有更高的遷移和侵襲活性（圖3G–J）。細胞劃痕結果顯示PAXIP1-AS1過表達導致傷口閉合顯著減慢，反之亦然（圖3K,L）。

為了研究PAXIP1-AS1對體內腫瘤生長的影響，將PAXIP1-AS1過表達的MKN-74細胞和對照細胞注射到小鼠體內建立皮下異種移植模型，結果顯示 PAXIP1-AS1過表達組的腫瘤體積更小，腫瘤增殖率也顯著降低（圖3F）。接著，研究者將PAXIP1-AS1過表達細胞和對照細胞注射到裸鼠尾靜脈，建立尾靜脈-肺轉移模型（圖3M），發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1過表達細胞在肺中形成的轉移結節(jié)更少（圖4I），IHC實驗確定了EMT標記物E-鈣粘蛋白和MMP2的表達情況：E-鈣粘蛋白在癌組織中表達較低，MMP2則較高。將PAXIP1-AS1過表達細胞和對照細胞分別注射到小鼠脾臟中建立脾內肝轉移模型，三周后解剖肝臟，發(fā)現(xiàn) PAXIP1-AS1組中觀察到的轉移瘤比對照更少（圖3N,O）。

這些研究結果表明PAXIP1-AS1的過表達能抑制腫瘤的增殖和轉移。

圖3

4、PAXIP1-AS1過表達顯著抑制了HOXD9誘導的胃癌細胞EMT和侵襲轉移

先前多個研究已報道HOXD9通過EMT改變促進腫瘤轉移，因此本研究進一步探討了PAXIP1-AS1是否參與HOXD9介導的腫瘤細胞遷移、侵襲和EMT。當過表達HOXD9后（圖4A），細胞呈現(xiàn)EMT特征，即紡錘狀的成纖維細胞形態(tài)，而共轉染HOXD9和PAXIP1-AS1會導致EMT的逆轉（圖4B）。采用鬼筆環(huán)肽染色F-actin發(fā)現(xiàn)，與單獨表達HOXD9相比，同時過表達HOXD9和PAXIP1-AS1會導致粗的F-actin蛋白絲部分解聚（圖4C），這與EMT誘導的表型相反。

HOXD9過表達導致MMP2和Vimentin上調， E-cadherin下調；與之相比，同時過表達HOXD9和PAXIP1-AS1的細胞中的MMP2和Vimentin表達降低，E-cadherin表達增加（圖4D）。Transwell技術實驗和細胞劃痕技術實驗表明， HOXD9過表達增加了GC細胞的侵襲和遷移潛力，同時過表達HOXD9和PAXIP1-AS1逆轉了這一現(xiàn)象（圖4E-G）。這些實驗結果表明HOXD9-PAXIP1-AS1信號通路調控GC細胞的EMT、遷移和侵襲。

圖4

5、GC細胞中的PAXIP1-AS1與PABPC1蛋白相互作用

研究者通過RNA pull down技術和質譜(MS)方法鑒定了312個PAXIP1-AS1的潛在結合蛋白（圖5A），其中參與多基因3′UTR調控的PABPC1蛋白引起了他們的注意。RNA pull down和WB檢測表明PAXIP1-AS1可以與PABPC1結合（圖5B），RNA免疫沉淀（RIP）技術實驗也再次確認了它們間的相互作用（圖5C）。接著，研究人員采用一系列PAXIP1-AS1突變體（圖5D）來進行RNA pull down WB實驗，最終確定PAXIP1-AS1的F1–F4區(qū)域與PABPC1蛋白結合。此外，構建帶His標簽的PABPC1全長及五個缺失突變體（圖5F）進行RIP qPCR實驗，發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1主要與PABPC1中的RRM4和PABC結構域結合（圖5G）。

那么PAXIP1-AS1與PABCS1的結合是否影響其蛋白的穩(wěn)定性呢？研究發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1過表達導致PABPC1蛋白質水平減少，但其mRNA水平未受影響（圖5H、I）。蛋白穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn)PAXIP1-AS1過表達促進了PABPC1蛋白的降解（圖5J）。蛋白酶體抑制劑MG132顯著減弱了PAXIP1-AS1過表達導致的PABPC1蛋白降解(圖5K)。泛素化實驗證實PAXIP1-AS1促進了PABPC1的泛素化(圖5L)。這些結果表明，PAXIP1-AS1可以直接與PABPC1蛋白結合，并通過泛素化促進其降解，從而調節(jié)其表達。

圖5

6、PAXIP1-AS1與PABPC1相互作用以調控GC細胞的轉移

研究者繼續(xù)調查了PAXIP1-AS1和PABPC1之間的相互作用是否具有功能。在體外GC細胞中，PAXIP1-AS1過表達增加了上皮標志物(E-cadherin)的表達，同時降低了間充質標志物（Vimentin和MMP2）的表達，降低了細胞遷移的數(shù)量和速率；PAXIP1-AS1和PABPC1共轉染逆轉了PAXIP1-AS1對GC細胞中EMT、細胞侵襲和遷移的抑制作用（圖6A–D）。此外，構建多個慢病毒感染細胞系并分別注射到裸鼠尾靜脈中（圖6E），結果發(fā)現(xiàn)靜脈接種PAXIP1-AS1細胞導致小鼠肺部可見腫瘤數(shù)量顯著減少，這與轉移基因座數(shù)量減少有關。相反，接種PAXIP1-AS1+PABPC1細胞則觀察到轉移基因座數(shù)量的增加（圖6F）?？笶-cadherin和MMP2蛋白的IHC染色進一步證實了裸鼠肺中GC轉移的存在（圖6G，H）。PAXIP1-AS1過表達組的肝臟轉移瘤更少，而PAXIP1-AS1+PAPPC1組逆轉了這一效果（圖6I、J）。這些數(shù)據(jù)表明PAXIP1-AS1與PABPC1協(xié)同調節(jié)GC細胞遷移和EMT。

圖6

7、PABPC1通過增強PAK1 mRNA的穩(wěn)定性促進胃癌轉移

由于PABPC1常結合mRNA來起調控作用，因此研究者使用AURA數(shù)據(jù)庫預測了PABPC1的結合基序（圖7A）并確定了PAPC1可能結合的mRNA。使用siRNA敲低PABPC1，qPCR檢測發(fā)現(xiàn)PAK1 mRNA的變化最顯著（圖7B）。放線菌素D阻斷mRNA合成后，PABPC1干擾細胞的PAK1 mRNA半衰期更短，表明PABPC1在轉錄后水平上增強了PAK1 mRNA的穩(wěn)定性（圖7C）。RIP qPCR實驗發(fā)現(xiàn)PAK1 mRNA在PABPC1-RNA結合復合物中有較高富集（圖7D）。野生型PAK1 3′UTR和突變型PAK1 3′UTR（突變PABPC1結合位點）的雙熒光素酶實驗結果表明，PABPC1可以與PAK1 3′UTR結合，從而提高其穩(wěn)定性（圖7E-F）。在PABPC1過表達細胞中干擾PAK1，可以通過EMT抑制PABPC1誘導的GC侵襲和轉移（圖7G–L）。WB技術檢測了PAXIP1-AS1、PABPC1和PAK1表達之間的關系，結果顯示PAXIP1-AS上調顯著降低了PAK1的表達（圖7M），表明PAXIP1-AS1參與調控GC細胞中PABPC1和PAK1的表達。

這些結果表明，PABPC1通過增強GC細胞中PAK1 mRNA的穩(wěn)定性來促進轉移和EMT。

圖7

8、人類胃樣本中PAXIP1-AS1的表達與HOXD9、PABPC1和PAK1的表達呈負相關

使用siRNA敲低HOXD9的表達后，PABPC1和PAK1的表達也顯著降低了（圖8A）。腫瘤樣本中HOXD9、PABPC1和PAK1通常上調，而PAXIP1-AS1經常下調（圖8B，C）。Pearson相關分析顯示，GC組織中PAXIP1-AS1和HOXD9（圖8D）、PAXIP1 AS1和PABPC1（圖8G），以及PAXIP1-AS1和PAK1（圖8H）呈負相關，而PABPC1和HOXD9之間的正相關性（圖8E），PAK1和HOXD9（圖8F），以及PAK1和PABPC1（圖8I）呈正相關。IHC和ISH結果顯示，GC中HOXD9、PABPC1和PAK1的表達顯著較高，而PAXIP1-AS1的表達顯著較低（圖8J）。這些結果表明，在GC樣品中，PAXIP1-AS1的表達與HOXD9、PABPC1和PAK1的表達呈負相關。

圖8

RNA pull down技術實驗—輝駿服務內容

RNA pull down實驗外包樣本要求

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