GST pull-down是體外驗(yàn)證蛋白直接互作的核心技術(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)尤其是對(duì)照組設(shè)置是實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)易受非特異性結(jié)合、GST標(biāo)簽自吸附干擾，嚴(yán)謹(jǐn)對(duì)照是排除干擾、滿足論文審稿要求的關(guān)鍵。輝駿生物將從實(shí)驗(yàn)原理、對(duì)照設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)流程、文獻(xiàn)應(yīng)用；四方面詳解GST pull down。

GST pull-down是什么？

GST pulldown 利用標(biāo)簽?配體的親和作用，在體外純化帶標(biāo)簽的目的蛋白，與裂解液孵育形成互作復(fù)合物，再通過親和介質(zhì)富集該復(fù)合物。

GST pull-down

• 目的：體外驗(yàn)證蛋白和蛋白之間的直接相互作用。

• 優(yōu)點(diǎn)：
  

  ①在樣本無IP級(jí)別抗體，且不能做標(biāo)簽抗體驗(yàn)證時(shí)首選；

  ②可以驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否為直接互作；

  ③可以與Co-IP或酵母雙雜共同驗(yàn)證一個(gè)問題。

• 缺點(diǎn)：
  

  ①構(gòu)建載體,誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；

  ②體外表達(dá)，非真實(shí)結(jié)合；

  ③難以檢測弱互作或瞬時(shí)互作。

注意：特別適用于強(qiáng)互作蛋白，也很適合研究蛋白間的直接相互作用。

GST pull-down實(shí)驗(yàn)對(duì)照

實(shí)驗(yàn)組為GST?X融合蛋白，對(duì)照組為GST空載體蛋白。 各取菌體裂解液作為Input，檢測蛋白表達(dá)與條帶位置， 兩組在相同條件下與含His?Y的裂解液孵育。

• Input對(duì)照

  目的：驗(yàn)證GST-X融合蛋白體外表達(dá)成功，并確認(rèn)互作蛋白共同表達(dá)。

• 對(duì)照組（陰性對(duì)照）—GST蛋白
  

  目的：表達(dá)GST空載蛋白與His-Y蛋白待測樣本，采用GST純化樹脂（輝駿貨號(hào)：FI8304）進(jìn)行pulldown實(shí)驗(yàn)，目的是為了排除GST 標(biāo)簽自身與誘餌蛋白的非特異性結(jié)合，避免因標(biāo)簽干擾造成的假陽性結(jié)果。

• 實(shí)驗(yàn)組—GST-X融合蛋白
  

  目的：表達(dá)GST-X融合蛋白與His-Y蛋白待測樣本，采用GST純化樹脂進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，檢測其與待測蛋白之間的特異性相互作用，明確兩種蛋白是否存在結(jié)合關(guān)系。

• 可選對(duì)照：流穿液檢測
  

  目的：收集與GST純化樹脂孵育后的上清液，通過蛋白定量或電泳檢測，評(píng)估GST融合靶蛋白的富集效率，判斷實(shí)驗(yàn)體系的有效性。

結(jié)果圖中 “+” 為加該蛋白，“-” 為不加。Input 均有條帶，說明蛋白表達(dá)正常。若 pull?down 洗脫液出現(xiàn) His?Y 條帶，即證明 GST?X 與 His?Y 存在直接相互作用。

GST pull-down實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程：GST誘餌蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、制備純化，待測樣本制備后進(jìn)行GST pull down，最終用WB或質(zhì)譜鑒定洗脫液蛋白。

體外表達(dá)帶標(biāo)簽誘餌蛋白并純化，與樣本裂解液孵育，漂洗去未結(jié)合蛋白后洗脫，通過WB或質(zhì)譜檢測洗脫液中互作蛋白。

ps：輝駿生物自有質(zhì)譜檢測平臺(tái)，擅長IP、pull-down產(chǎn)物等微量蛋白的質(zhì)譜鑒定及生信分析

GST pull-down文獻(xiàn)解讀

1.GST pull-down驗(yàn)證蛋白是否存在直接相互作用

從圖中可以看到Lysate（即Input組）所有轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)對(duì)應(yīng)蛋白條帶，說明目的蛋白均成功表達(dá)，而且可以看到GSNOR蛋白加了GST-tag，比單純的GST標(biāo)簽蛋白分子量要高很多。

泳道① GST-vector蛋白+Myc-NEDD4為對(duì)照組，泳道② GST-GSNOR蛋白+Myc-NEDD4為實(shí)驗(yàn)組。泳道①、②是利用GST-Pulldown拉下來的復(fù)合物，泳道②的GST-GSNOR蛋白能夠下拉到His-CsATG8c蛋白，因此通過GST pull-down證明了GST-GSNOR蛋白與Myc-NEDD4蛋白存在直接相互作用。

2.GST pull-down驗(yàn)證兩個(gè)蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域

對(duì)照組用的是GST空載蛋白，實(shí)驗(yàn)組是GST-USP5融合蛋白的全長及不同截短體。從圖中可以看到WCL（即Input組）檢測到HA蛋白條帶，從銀染膠上也可以看到純化后GST蛋白和GST-USP5融合蛋白的全長和截短體條帶，說明蛋白均成功表達(dá)。

就可以往下看pull down，這里是用GST純化樹脂進(jìn)行pull-down，發(fā)現(xiàn)GST-USP5全長能夠富集到HA蛋白條帶，說明GST-USP5與PD-1-cHA蛋白存在直接相互作用。而缺失GST-USP5的UBA1/2這一段發(fā)現(xiàn)條帶消失，說明GST-USP5的UBA1/2這一段是與PD-1-cHA蛋白結(jié)合區(qū)域。

輝駿生物GST pull-down試劑盒—客戶應(yīng)用案例

2025年7月23日，重醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院趙明明/宋晶團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表論文，探討了DSS1在ccRCC轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用及分子機(jī)制，為其治療提供新思路。

作者通過GST pull down實(shí)驗(yàn)（由輝駿生物提供試劑盒）進(jìn)行DSS1與LC3蛋白、TRIM25與LC3蛋白相互作用驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)DSS1與LC3蛋白，TRIM25與LC3蛋白均存在直接相互作用（詳見圖1a、b）。

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