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當(dāng)誘餌蛋白IP抗體不好用或者內(nèi)源表達(dá)量低時(shí)，可以在樣本中融合表達(dá)帶有特定標(biāo)簽的誘餌蛋白（Bait），利用標(biāo)簽抗體做免疫沉淀。

樣本裂解后，與偶聯(lián)了標(biāo)簽抗體的beads孵育，將“誘餌蛋白-互作蛋白”一起“共沉淀”到抗體Beads上。洗掉未結(jié)合的蛋白后，再將“誘餌蛋白-互作蛋白”從Beads上洗脫下來(lái)，得到Co-IP洗脫液，該洗脫液既可用于Western  Blot檢測(cè)（驗(yàn)證已知結(jié)合蛋白），也可用于質(zhì)譜鑒定（篩選未知結(jié)合蛋白）。

圖1 標(biāo)簽蛋白Co-IP實(shí)驗(yàn)原理圖

實(shí)驗(yàn)大致步驟（以在HEK293T細(xì)胞調(diào)取Flag-Bait蛋白為例）：細(xì)胞鋪板→質(zhì)粒轉(zhuǎn)染→總蛋白提取→Input樣品制備→總蛋白與Flag磁珠孵育→蛋白洗脫→WB檢測(cè)是否存在靶蛋白/質(zhì)譜鑒定洗脫液中的蛋白。

1 細(xì)胞鋪板

（1）轉(zhuǎn)染前HEK293T細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1.5×10⁶/皿鋪至6 cm皿中，十字法鋪勻細(xì)胞；

（2）置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%且狀態(tài)良好時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。

2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 

（1）取兩個(gè)1.5 mL EP管各加入200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，A管加入6 μg質(zhì)粒，B管按質(zhì)粒：PEI=1：3的比例加入18 μL PEI；

（2）混勻、瞬時(shí)離心后室溫靜置5 min，后將兩個(gè)EP管中液體混為一管，室溫靜置20 min；

（3）用200 μL加樣槍將EP管中的液體均勻滴加入HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中，并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

3 總蛋白提取

（1）轉(zhuǎn)染48 h后用IP裂解液（輝駿貨號(hào)為：FI8101）提蛋白。

（2）用預(yù)冷PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，加入300-500 μL預(yù)冷的IP裂解液，在IP裂解液中預(yù)先加入3-5 μL蛋白酶抑制劑（輝駿貨號(hào)為：FI8105），現(xiàn)用現(xiàn)配；

（3）4℃混勻儀上裂解30 min；

（4）為了更充分裂解，最好冰上超聲至溶液基本澄清（如果無(wú)超聲條件，可置于冰上裂解30 min，期間每10 min渦旋混勻一次，每次5 s）；

（5）4℃離心機(jī)12000 rpm離心15 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中。

4 Input樣品制備

（1）所提蛋白每組各取30 μL，加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液充分混勻；

（2）95℃加熱5-10 min，通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

5 總蛋白與Flag磁珠孵育

（1）磁珠預(yù)處理：每組取10-20 μL Anti-Flag納米抗體磁珠（輝駿貨號(hào)為：FI8201），加入200 μL漂洗緩沖液（輝駿貨號(hào)為：FI8107），顛倒混勻30次；

（2）放磁力架上靜置1 min，棄上清；

（3）重復(fù)上述洗滌步驟1次；

（4）向磁珠中加入相應(yīng)組別的樣本裂解液，充分混懸，置于4℃混勻儀上孵育2 h或4℃孵育過(guò)夜；

（5）放磁力架上靜置1 min，棄上清，加入500 μL漂洗緩沖液，顛倒混勻30次；

（6）放磁力架上靜置1 min ，棄上清，重復(fù)上述洗滌步驟2次。

圖2 標(biāo)簽蛋白Co-IP實(shí)驗(yàn)分組流程圖

（2）放磁力架靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，進(jìn)行SDS-PAGE或Western Blot檢測(cè)，如果需要進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，則切膠條后送檢。

6.2 非變性洗脫 

（1）向磁珠中加入40-50 μL洗脫緩沖液（輝駿貨號(hào)為：FI8102），渦旋振蕩20 s，放混勻儀上室溫洗脫10-15 min，渦旋振蕩20 s；

（2）1000 g離心20 s，放磁力架上靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脫后的蛋白-80℃保存，或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)。

7 WB檢測(cè)是否存在靶蛋白/質(zhì)譜鑒定洗脫液中的蛋白

7.1 WB檢測(cè)是否存在靶蛋白

通過(guò)蛋白印跡(Western Blot)技術(shù)分別使用Anti-Flag和Anti-Prey對(duì)沉淀中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，若能夠檢測(cè)在沉淀中同時(shí)存在誘餌蛋白和獵物蛋白，則說(shuō)明這兩種蛋白之間存在相互作用。

7.2 質(zhì)譜鑒定洗脫液中的蛋白

通過(guò)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)IP洗脫液中的蛋白成分進(jìn)行鑒定和分析，篩選誘餌蛋白的未知互作蛋白。

PS：輝駿生物自有質(zhì)譜檢測(cè)平臺(tái)，擅長(zhǎng)IP、pull-down產(chǎn)物等微量蛋白的質(zhì)譜鑒定及生信分析。

1.保證加入蛋白酶抑制劑，實(shí)驗(yàn)需在冰上操作，避免蛋白出現(xiàn)降解；

2.使用合適的洗脫液，保證洗脫液的強(qiáng)度和PH值合適；

3.清洗次數(shù)會(huì)影響最終結(jié)果，清洗次數(shù)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致弱結(jié)合蛋白被洗脫，檢測(cè)信號(hào)弱；清洗次數(shù)過(guò)低會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合未被清洗干凈，信噪比高；

4.IP實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照組，通常采用表達(dá)Flag標(biāo)簽空載體的樣本作為對(duì)照；

5.商業(yè)化的Flag磁珠將Flag抗體共價(jià)偶聯(lián)在磁珠上，當(dāng)采用非變性洗脫法時(shí)不易產(chǎn)生抗體污染，但如果用熱變性洗脫，還是會(huì)檢出部分抗體，出現(xiàn)“抗體輕重鏈污染”問(wèn)題。

PS:輝駿生物標(biāo)簽納米抗體磁珠結(jié)合量高，親和力強(qiáng)，無(wú)輕重鏈污染。