RNA pull down是體外條件下尋找目標(biāo)RNA的結(jié)合蛋白的方法。使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，將體外轉(zhuǎn)錄的RNA結(jié)合到Beads上，再將RNA-Beads和細(xì)胞裂解液孵育，這樣與目標(biāo)RNA結(jié)合的蛋白便會(huì)一起吸附在Beads上。

洗滌掉不結(jié)合的蛋白后，用洗脫液將RNA-蛋白復(fù)合物從Beads洗脫下來，即RNA pull-down產(chǎn)物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。

這種互作復(fù)合物既可以用Western Blot檢測(cè)特定的結(jié)合蛋白，還可以采用質(zhì)譜方法鑒定與目標(biāo)RNA結(jié)合的未知蛋白。

實(shí)驗(yàn)大致流程：RNA探針制備→總蛋白提取→磁珠預(yù)處理→RNA PullDown（磁珠-RNA探針復(fù)合物富集互作的蛋白）→蛋白洗脫→WB檢測(cè)是否存在靶蛋白/質(zhì)譜鑒定洗脫液中的蛋白

1 RNA探針制備

目前，體外RNA探針主要采用生物素標(biāo)記，操作復(fù)雜且成本高。輝駿生物自主研發(fā)了一種用RNA標(biāo)簽“F2”來標(biāo)記目標(biāo)RNA探針的方法（已申請(qǐng)專利，已有文獻(xiàn)引用），使標(biāo)記更簡(jiǎn)單，成本更低。以下詳細(xì)介紹下兩種標(biāo)記方法。

1.1 生物素標(biāo)記的RNA探針制備

（1）構(gòu)建RNA過表達(dá)質(zhì)粒：基因合成+測(cè)序驗(yàn)證；

（2）體外轉(zhuǎn)錄模板準(zhǔn)備：根據(jù)目標(biāo)RNA序列設(shè)計(jì)帶有T7啟動(dòng)子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物，以目標(biāo)序列的DNA質(zhì)粒為模板，PCR分別獲得T7-正義RNA（實(shí)驗(yàn)組）和T7-反義RNA（對(duì)照組）轉(zhuǎn)錄模板，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書要求回收純化目標(biāo)DNA；

（3）體外轉(zhuǎn)錄：以上述DNA為模板，加入相應(yīng)的RNA體外轉(zhuǎn)錄配置的反應(yīng)體系（含生物素UTPs），37℃孵育2 h，再加入1 μL DNase I，37℃孵育15 min將DNA模板消化，得到正義和反義RNA；

（4）為了避免轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的游離生物素UTP 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁珠，此處最好采用 RNA 純化試劑盒來處理轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但此操作可能造成一定的產(chǎn)物損失，可以根據(jù)具體情況決定是否進(jìn)行此步操作；

（5）使用Nanodrop（紫外分光光度計(jì)）檢測(cè)RNA濃度，取1-2 μL RNA進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量和長(zhǎng)度；符合要求的 RNA 置于- 80℃保存或直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 F2標(biāo)記的RNA探針制備

（1）操作方法與生物素標(biāo)記的RNA探針類似，但在制備DNA模板時(shí)，需要將17bp的F2序列一起加入到引物中。RNA體外轉(zhuǎn)錄體系則無需再加入生物素UTPs，節(jié)省了成本，后續(xù)也不需要進(jìn)行RNA純化操作，簡(jiǎn)化了操作步驟。

（2）以上述DNA為模板，加入相應(yīng)的RNA體外轉(zhuǎn)錄配置的反應(yīng)體系（無需再加生物素UTPs），37℃孵育2 h，再加入1 μL DNase I，37℃孵育15 min 將DNA模板消化，得到正義和反義RNA。

2??當(dāng)目標(biāo)序列過短（＜300bp）或過長(zhǎng)（＞4kb）時(shí)，探針制備難度將增加；長(zhǎng)序列可以分段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 總蛋白提取

2.1 細(xì)胞樣本

（1）培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度，收集細(xì)胞；

（2）用預(yù)冷PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，加入0.6-1 mL預(yù)冷的裂解緩沖液（輝駿貨號(hào)：FI8101），在裂解液中預(yù)先加入6-10 μL蛋白酶抑制劑（輝駿貨號(hào)：FI8105）、3-5 μL RNA酶抑制劑（輝駿貨號(hào)：FI8106），現(xiàn)用現(xiàn)配；

（3）4℃混勻儀上裂解30 min或者冰上超聲至溶液基本澄清（如果無超聲條件，可置于冰上裂解30 min，期間每10 min渦旋混勻一次，每次5 s）；

（4）4℃離心機(jī)12000 rpm離心15 min，收集上清至新的1.5 mL無RNase EP管中；

（5）取30 μL作為input，剩余上清平分為兩份用于RNA pull-down實(shí)驗(yàn)（記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組），置于冰上備用或-80℃保存。

2.2 組織樣本

（1）采用預(yù)冷的PBS清洗新鮮組織，去除血液等成分；

（2）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取0.2-0.4 g干凈的組織，用液氮在研缽中充分研磨，隨后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的無RNase、新的EP管中；

（3）將樣本置于冰上，加入0.6-1 mL預(yù)冷的裂解緩沖液，在裂解液中預(yù)先加入6-10 μL蛋白酶抑制劑、3-5 μL RNA酶抑制劑，吹打混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

（4）4℃混勻儀上裂解30 min或者冰上超聲至溶液基本澄清；

（5）4℃離心機(jī)12000 rpm離心15 min，收集上清至新的1.5 mL無RNase EP管中；

（6）取30 μL作為input，剩余上清平分為兩份用于RNA pull-down實(shí)驗(yàn)（記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組），置于冰上備用或- 80℃保存。

3 磁珠預(yù)處理

(1) 將鏈霉親和素磁珠（輝駿貨號(hào)：FI8303）上下顛倒混勻，取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組一共所需的80 μL 磁珠到新的無RNase EP管中；

(2) 加入1 mL NT2緩沖液，顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min 并棄上清；

(3) 重復(fù)上步操作一次；

(4) 加入400 μL NT2緩沖液，上下顛倒重懸磁珠；

(5) 將磁珠平分為兩份，每組各約200 μL，轉(zhuǎn)移到新的無 RNase EP管中，記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

4 RNA pull-down

(1) 取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組RNA探針各3 μg，95℃加熱變性3 min，冰浴1 min，瞬離，向管中加入50 μL RNA結(jié)構(gòu)緩沖液，室溫放置30 min；

(2) 將RNA探針分別加入對(duì)應(yīng)的磁珠中，混勻儀上室溫孵育30 min；

(3) 放磁力架上靜置1 min，并棄上清；

(4) 每組加入500 μL漂洗液，顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min，并棄上清；

(5) 重復(fù)上步操作一次；

(6) 加入相應(yīng)組別的樣本裂解液，混勻儀上4℃孵育2~4 h；

(7) 放磁力架上靜置1 min 并棄上清；

(8) 每組加入 500 μL 漂洗液，顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min 并棄上清；

(9) 重復(fù)上步漂洗操作兩次，共漂洗三次，保留磁珠。

5 蛋白洗脫

5.1 變性洗脫

（1）向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液進(jìn)行洗脫，振蕩混勻后瞬離，95℃加熱5-10 min；

（2）放磁力架靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，進(jìn)行SDS-PAGE或Western Blot檢測(cè)，如果需要進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，則切膠條后送檢。

5.2 非變性洗脫 

（1）向磁珠中加入50 μL洗脫緩沖液（輝駿貨號(hào)為：FI8102），渦旋振蕩20 s，放混勻儀上室溫洗脫10-15 min，渦旋振蕩20 s；

（2）1000 g離心20 s，放磁力架上靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脫后的蛋白-80℃保存，或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)。

2??RNA pull-down捕獲的蛋白量通常較少，因此SDS-PAGE膠建議用硝酸銀染色，檢測(cè)富集蛋白的情況。

6 WB檢測(cè)是否存在靶蛋白/質(zhì)譜鑒定洗脫液中的蛋白

6.1 WB檢測(cè)是否存在靶蛋白

通過蛋白印跡(Western Blot)技術(shù)使用Anti-Prey對(duì)沉淀中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，若能夠檢測(cè)在目標(biāo)RNA沉淀中有清晰Prey條帶，則說明存在特異性相互作用。

6.2 質(zhì)譜鑒定洗脫液中的蛋白

通過質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異蛋白，進(jìn)而篩選可能的互作蛋白。

Input組（陽性對(duì)照組）：樣本裂解液；

Antisense（對(duì)照組）：目標(biāo)RNA反義鏈探針的pull-down產(chǎn)物；

Sense（實(shí)驗(yàn)組）：目標(biāo)RNA正義鏈探針的pull-down產(chǎn)物。

先看Input組：驗(yàn)證Input組需檢測(cè)到待測(cè)蛋白（Prey）條帶。若Input組無信號(hào)，說明樣本中待測(cè)蛋白未提取成功或濃度過低，后續(xù)Sense組和 Antisense組的結(jié)果無意義，需重新優(yōu)化蛋白提取步驟。

再比較Sense組與Antisense組：判斷特異性相互作用。若Sense組檢測(cè)到待測(cè)蛋白（Prey）條帶，且Antisense組無條帶或條帶極弱，說明目標(biāo)RNA正義鏈能特異性結(jié)合待測(cè)蛋白，可判定二者存在相互作用。

RNA pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)RNA與待測(cè)蛋白（Prey）是否存在相互作用，如果最終的結(jié)果Sense組有條帶，則可以證明之間存在相互關(guān)系。上圖為RNA pull-down陽性結(jié)果示意圖：表明目標(biāo)RNA可以與Prey蛋白結(jié)合，存在相互作用。

?注意：

2??如果Sense組與Antisense組均未檢測(cè)到待測(cè)蛋白信號(hào)：需先確認(rèn)Input組是否有信號(hào)，若Input組有信號(hào)則可能是探針與蛋白結(jié)合效率低（如探針標(biāo)記失敗、孵育條件不當(dāng)），需排查探針制備或孵育步驟。

1 RNA pull down試劑盒

2 RNA pull down實(shí)驗(yàn)服務(wù)

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