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DNA pull down是一種體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)。它通過特異性DNA序列捕獲并鑒定與之結(jié)合的蛋白，尤其適用于尋找基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。

輝駿生物在本文將系統(tǒng)介紹DNA pulldown技術(shù)原理、實驗流程、注意事項、結(jié)果解讀、文獻應(yīng)用及常見問題與解決方案，為您提供清晰實用的實驗參考。

如有任何技術(shù)問題或產(chǎn)品訂購需求，歡迎隨時聯(lián)系我們：18927549347、13430303037（微信同號）。

DNA pull down是體外條件下研究目標DNA片段與蛋白質(zhì)相互作用的重要技術(shù)。其基本原理是先體外制備帶有生物素標記的DNA探針；之后，生物素DNA探針結(jié)合到鏈霉親和素磁珠上；再將DNA-Beads與細胞裂解液孵育，這樣DNA結(jié)合蛋白便一起吸附在Beads上；洗滌掉未結(jié)合的蛋白后，再用洗脫液將DNA結(jié)合蛋白從Beads洗脫下來，得到DNA pull down產(chǎn)物。

這種DNA-protein復(fù)合物既可以用Western Blot檢測已知的結(jié)合蛋白，還可以采用質(zhì)譜方法鑒定與目標DNA結(jié)合的未知蛋白。

圖1 DNA pull-down實驗原理圖

1、質(zhì)粒準備

構(gòu)建含目的基因序列的質(zhì)粒，這是后續(xù)實驗的基礎(chǔ)，為后續(xù)的 PCR 擴增提供模板，確保所研究的特定 DNA 序列能夠被準確地擴增和操作，從而用于捕獲與之相互作用的蛋白質(zhì)。

注意：可同時構(gòu)建突變體質(zhì)粒（突變核心結(jié)合位點）作為陰性對照，排除非特異性結(jié)合干擾。

2、生物素標記的DNA探針制備

根據(jù)目標 DNA 序列設(shè)計并合成生物素標記的引物和未標記的引物，以目的基因質(zhì)粒為模板，PCR 擴增分別得到生物素標記的 DNA 探針（實驗組）和未標記的探針（對照組），用DNA凝膠回收試劑盒進行探針的回收純化。

3、蛋白樣本制備

3.1 總蛋白提取

(1)將兩組樣本（實驗組+對照組）按照如下方法收集和處理：

圖3 DNA pull-down實驗分組圖

3.2 核蛋白提取

如果提取核蛋白，需要自備核蛋白提取試劑盒，并按照說明書操作。提取好的核蛋白取 30 μL 作為 input，剩余平分為兩份用于 DNA pull-down 實驗（記為實驗組和對照組），置于冰上備用或- 80℃保存。

注意：提取核蛋白所需的樣本量約為總蛋白的兩倍，但具體使用量還需要根據(jù)實際操作來摸索；根據(jù)經(jīng)驗，樣本總蛋白濃度通常不低于 5 μg/μL，總量約 2~3 mg。

4、DNA pull-down

1. 3 μg 探針 + 鏈霉親和素磁珠（輝駿貨號 FI8303），室溫混 30 min。  

2. 磁力架 1 min，棄上清。  

3. 500 μL 漂洗液顛倒 30 次，磁力架 1 min，棄液；再洗 1 次。  

4. 加對應(yīng)裂解液，4 ℃混 2–4 h。  

5. 磁力架 1 min，棄上清。

5、洗滌

(1) 每組加入 500 μL 漂洗液，顛倒混勻 30 次，放磁力架上靜置 1 min 并棄上清；

(2) 重復(fù)上步操作兩次，共漂洗三次，保留磁珠。

6、洗脫

6.1 非變性洗脫法

磁珠加50 μL洗脫液，渦旋20 s，室溫10–15 min，再渦旋20 s；1000 g 20 s，磁力架1 min，取上清，–80 ℃存，保持活性，可直接用于質(zhì)譜、WB等。

6.2 SDS-PAGE 上樣緩沖液洗脫法（變性洗脫法）

向磁珠中加入 50 μL 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min；磁力架上靜置 1 min，收集上清至新的離心管中。該洗脫產(chǎn)物適用于 SDS-PAGE 或 Western Blot 檢測；如果需要進行質(zhì)譜檢測，則切膠條后送檢。

注意：根據(jù)實驗需求，可選擇非變性洗脫法或變性洗脫法進行洗脫；由于DNA pulldown 捕獲的蛋白量通常較少，建議將SDS-PAGE 膠用硝酸銀染色。

7、WB檢測是否存在靶蛋白/質(zhì)譜檢測洗脫液中的蛋白

PS：輝駿生物自有質(zhì)譜檢測平臺，擅長IP、pull-down產(chǎn)物等微量蛋白的質(zhì)譜鑒定及生信分析

1.  DNA探針需經(jīng)電泳驗證完整性。

2.  細胞或組織裂解應(yīng)充分、均勻，以保證蛋白完整與活性。

3.  洗滌步驟應(yīng)適度，避免過度洗脫特異性結(jié)合蛋白。

4.  選擇適宜的蛋白分析方法，以確保結(jié)合蛋白的準確鑒定與定量。

實驗?zāi)繕耍汉Y選與目標 DNA 序列結(jié)合的蛋白質(zhì)

(1) 未標記組：未標記目標 DNA 探針的 pull-down 產(chǎn)物（對照組）；

(2) 標記組：生物素標記目標 DNA 探針的 pull-down 產(chǎn)物（實驗組）。

圖5 DNA pull-down蛋白銀染圖

輝駿生物技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢?：

• 一站式：探針設(shè)計→pull down→LC-MS/MS→生信分析，全程自建平臺。

• 高靈敏：10?12 mol 級蛋白檢出率＞95%，微量樣本（≥30 μg）即可開工。

• 低背景：專利封閉磁珠（貨號 FI8303）+ 嚴苛漂洗體系，非特異 <5%

• ?文獻級成果?：眾多DNA pulldown客戶服務(wù)案例發(fā)表于高影響力期刊，助力疾病機制研究。

  
  

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1、DNA pull-down產(chǎn)品